食用菌学报

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利用CRISPR/Cas9基因编辑与杂交技术靶向创制灵芝基因位点纯合突变株的方法

田佳琳, 董蓓蓓, 唐传红, 周帅, 冯娜, 冯杰, 张劲松, 谭贻

2025, 32(3): 1-12. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.001

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以营养缺陷型筛选标记基因ura3为靶标,利用基于核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9）基因编辑技术,对灵芝（Ganoderma lucidum）双核菌株‘沪农灵芝1号’G0119及从其分离的2个交配亲和的单核菌株L1、L2进行基因编辑,比较单双核的编辑效率;对编辑的2个单核,进行杂交,以获得ura3被编辑的双核基因位点纯合菌株。结果表明：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得G0119双核编辑株7个,经双单杂交实验鉴定,有6个G0119编辑株为L1核被编辑,1个为L2核被编辑,7个编辑株均为杂合子;获得L1、L2的单核编辑株分别为10、7个,其中L1核被编辑的效率为100%。将突变类型均为C碱基缺失的单核L1-2和L2-1编辑株以及A插入碱基的L1-5和L2-3编辑株分别进行单单杂交,获得2株ura3被破坏的双核纯合菌株。利用CRISPR/Cas9基因编辑与杂交技术靶向创制灵芝基因位点纯合菌株的方法,可为创制灵芝其他功能基因的基因位点纯合菌株提供新的方法,也可为灵芝双核菌株的基因表型分析研究提供新的途径。

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基于转录组分析金针菇子实体发育过程中GABA生物合成机制

李文云, 卢雪伟, 邵悠然, 王瑞娟, 尚晓冬, 冯占, 李贺文, 吴莹莹

2025, 32(3): 13-27. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.002

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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）是广泛存在于食用菌中的一种具有重要生理功能的活性非蛋白质天然氨基酸,在金针菇（Flammulina filiformis）中含量较高。为探讨金针菇发育过程中GABA的生物合成机制,笔者利用转录组分析搔菌后生长15、21、25 d的金针菇子实体样品（搔菌后15~21 d为伸长期,21~25 d为成熟期）,并检测各样品的GABA及其合成前体含量,挖掘GABA生物合成相关基因,并用荧光定量PCR（RT-qPCR）和合成途径关键物质添加实验进行验证。结果表明：随着生长时间的延长,金针菇中GABA及其合成前体谷氨酸、鸟氨酸的含量均呈现先上升后下降的趋势,而精氨酸含量则持续上升。GO功能富集分析显示,差异表达基因（DEGs）主要富集于腐胺分解代谢、多胺分解代谢、鸟氨酸生物合成和谷氨酸代谢等条目。KEGG代谢通路分析显示,DEGs主要富集于多种氨基酸代谢以及类固醇、叶酸的生物合成等通路。在子实体的伸长期和成熟期分别筛选到869个和641个DEGs,经RT-qPCR验证和功能预测分析,推测其中scaffold1.g1430、scaffold1.g390、scaffold6.g197、scaffold9.g519、scaffold11.g88是金针菇GABA生物合成相关的重要基因,参与GABA支路途径和多胺降解途径的多种前体物质合成过程。在金针菇液体培养基中添加0.5 g·L^-1的L-谷氨酸和0.2 g·L^-1氯化钙均可有效提升菌丝体的GABA含量,进一步说明GABA支路可能参与金针菇GABA的合成。本研究结果可为阐明金针菇的GABA代谢通路提供参考。

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刺芹侧耳苯丙氨酸解氨酶基因表达和酶活性与菌盖颜色相关性

聂梦涵, 陈莉莉, 罗莉媛, 张拓, 谢宝贵

2025, 32(3): 28-37. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.003

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对刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）菌株Pe0100苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）序列进行分析,对PAL基因在菌丝、原基、幼菇、伸长、成熟5个时期的表达量进行分析,并对其在幼菇、伸长、成熟3个时期的菌盖和菌柄表达差异进行分析,构建过表达载体Pe-PAL1转化刺芹侧耳菌株Pe0100,分别对野生型菌株和过表达菌株的表型进行观察;对过表达菌株成熟期菌盖表皮组织PAL酶活性与基因表达量进行相关性分析。结果表明：Pe0100基因组中有2个苯丙氨酸解氨酶编码基因PePAL1、PePAL2;与菌柄相比,PePAL1在幼菇、伸长、成熟3个时期的菌盖中表达量较高;PePAL2在菌丝期表达量最高。共获得4个过表达菌株OE#3、OE#10、OE#16、OE#18,其菌盖表皮均产生深褐色条纹状色素沉着,且成熟期菌盖PePAL1基因表达量与酶活性正相关。研究结果为刺芹侧耳品种选育提供参考。

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基于转录组分析高温对六妹羊肚菌菌丝体基因表达的影响

胡鑫钰, 翟梦丹, 陈泽威, 李汪麒, 黄凯文, 张宇辰, 王震

2025, 32(3): 38-50. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.004

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研究高温（33 ℃）胁迫对六妹羊肚菌（Morchella sextelata）菌丝体基因表达的影响,通过转录组测序,筛选高温组差异表达基因,随机选取5个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR对转录组数据进行验证,并通过Pearson系数分析实时荧光定量PCR结果与转录组数据的相关性,对差异表达基因进行 GO 功能和KEGG 代谢途径富集分析,根据筛选出的代谢途径,进行基因集的富集分析,筛选参与菌丝体响应高温胁迫的关键基因。结果表明：与对照组相比,高温组有2 112个差异表达基因,其中799个基因上调表达,1 313个基因下调表达;5个差异表达基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果显著正相关（R²=0.88）;GO功能分析结果表明,差异表达基因主要显著富集在DNA复制、脂质代谢等生物过程,膜组分等细胞组分,DNA结合、药物结合等分子功能;KEGG代谢途径分析结果表明,差异表达基因富集在错配修复、ABC转运蛋白、淀粉和蔗糖代谢、丙酮酸代谢、氨基酸的生物合成、双组分系统、RNA降解、碳代谢等代谢途径;与高温胁迫相关的10个关键差异表达基因包括DNA解旋酶、分子伴侣蛋白、丙酮酸激酶、苹果酸-乳酸酶、ATP结合蛋白、多药耐药性外排泵蛋白、磷酸连接酶、组氨酸激酶、转酮醇酶和果糖-6-磷酸酮醇酶基因。研究结果为解析六妹羊肚菌响应高温胁迫的分子机制提供参考。

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六妹羊肚菌几个发育阶段细胞核变化

王晓敏, 张钦语, 樊扬, 张邦喜

2025, 32(3): 51-58. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.005

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采用荧光显微镜观察六妹羊肚菌（Morchella sextelata）的子囊、子囊孢子、初生菌丝和次生菌丝的细胞核结构。研究结果表明：子囊母细胞初期细胞核数量为10~24,细胞核向子囊尖端移动聚集,细胞分裂后形成8个椭圆状的子囊孢子依次竖排排列;子囊孢子从子囊中弹出后,培养6 h的子囊孢膨大到约为原来的2倍,细胞核数量由9~15增加到21~27;孢子尖端凸起长出1~2个芽管,芽管不断伸长生长并形成隔膜。初生菌丝既有单交配型也有双交配型,次生菌丝均为双交配型。初生菌丝和次生菌丝细胞核形态存在差异,大部分初生菌丝的细胞核是颗粒状,体积较小,每个细胞的细胞核数量为25~52,大部分次生菌丝从细胞核是团状,体积较大,每个细胞的细胞核数量为3~10;细胞核呈团状或粒状均可通过隔膜在细胞之间运输遗传物质。

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预冷处理对草菇采后保鲜的影响

李晓晖, 李袁媛, 汪雯翰, 张劲松, 杨焱, 陈万超, 贾薇

2025, 32(3): 59-72. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.006

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将采摘的新鲜草菇（Volvariella volvacea）分为预冷组、不预冷组和室温组,研究预冷处理对草菇采后保鲜的影响。预冷组,将草菇用冷风预冷至（15±1） ℃后置于（15±١） ℃、相对湿度(80±5)%的环境;不预冷组,将草菇直接置于（15±1） ℃、相对湿度（80±5）%的环境;室温组,将草菇直接置于室温、相对湿度的环境。结果表明：(15±1) ℃、相对湿度(80±5)%的贮藏条件可以有效延缓草菇品质下降;而预冷处理能在此基础上更好地延缓草菇褐变和失水变软,抑制丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量上升以及降低多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）活性。预冷处理可减缓线粒体膜电位下降速度,使TCA循环速率维持在相对稳定的水平,延缓线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性的下降,保持较高的ATP含量,将草菇的保鲜期由1 d延长至4 d。研究结果为预冷处理在草菇采后保鲜中的应用提供参考。

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卵孢血芝生物学特性及驯化

牛开阳, 韩林, 李正聪, 冯文早, 罗宗龙, 唐松明

2025, 32(3): 73-80. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.007

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从云南德宏州采集野生卵孢血芝（Sanguinoderma ovisporum）子实体,组织分离获得菌株FDCU XZ-3,研究其生物学特性,并对其驯化。结果表明：菌株FDCU XZ-3菌丝生长最适温度、碳源、氮源、无机盐分别为28 ℃、果糖、大豆蛋白胨、氯化钠;通过覆土栽培获得卵孢血芝子实体,菌盖大小为（10.20±١.٩٤） cm×（٧.٣٦±٢.٤٣） cm,厚度为（0.4±0.1） cm,每朵干重为（12.60±٤.٧٩） g。研究结果可为卵孢血芝栽培和开发利用提供参考。

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多脂鳞伞水提物对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用

王晓岩, 李刚, 孔凡丽, 贺智杰, 谈中玉

2025, 32(3): 81-90. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.008

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制备多脂鳞伞（Pholiota adiposa）水提物（WPA）并进行营养成分分析;建立H22荷瘤小鼠模型,设立对照组、模型组、阳性组（环磷酰胺剂量为25 mg· kg^-1）、WPA组（低、中、高剂量分别为100、200、300 mg·kg^-1,命名为L-WPA、M-WPA、H-WPA）,连续给药20 d,测定抑瘤率、脏器指数,采用ELISA酶联免疫法检测小鼠血清中与癌症相关的生化因子含量,采用苏木素-伊红（HE）染色肿瘤组织,采用TUNEL法测定肿瘤细胞凋亡情况,采用免疫组化法和蛋白免疫印迹法检测与肿瘤凋亡相关蛋白表达量。结果表明：与模型组相比,M-WPA、H-WPA的胸腺指数和脾脏指数显著增加;L-WPA、M-WPA、H-WPA的肿瘤质量极显著降低,IL-2、IFN-γ、TNF-α含量显著增加,IL-6、VEGF、AST、BUN含量显著降低,凋亡率显著增加,BAX、Caspase-3、Cleaved caspase-3表达量显著增加,Bcl-2、VEGF表达量显著降低。研究结果可为多脂鳞伞开发应用提供参考。

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采用振荡-静置循环培养策略制备灵芝菌丝体的水提物抗氧化活性

王星, 冯杰, 姜幸怡, 刘艳芳, 韩伟, 张劲松

2025, 32(3): 91-101. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.009

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分别用250 mL摇瓶,3、5、50 L发酵罐采用振荡-静置循环培养策略（振荡2.8 d-静置7.3 d-振荡0.2 d-静置0.3 d）制备灵芝（Ganoderma lucidum）菌丝体（优化组）,对照组振荡培养10 d,测定菌丝体生物量、总三萜含量以及菌丝体水提物总三萜、总酚、总糖含量,研究菌丝体水提物对ABTS、DPPH、超氧阴离子和羟基自由基清除率。结果表明：不同发酵规模优化组菌丝体总三萜含量均高于对照组。优化组之间比较,发酵罐生物量较高,250 mL摇瓶菌丝体总三萜含量最高;3 L发酵罐菌丝体水提物总三萜、总糖含量最高,250 mL摇瓶、3 L发酵罐菌丝体水提物总酚含量较高;3 L发酵罐菌丝体水提物对ABTS自由基清除效果最好,IC₅₀为（12.31±0.23） mg·mL^-1;250 mL摇瓶菌丝体水提物对DPPH自由基的清除效果最好,IC₅₀为（4.53±0.24） mg·mL^-1;3、50 L发酵罐菌丝体水提物对超氧阴离子自由基的清除效果较好,IC₅₀分别为（12.29±0.61）、（12.66±0.68） mg·mL^-1;250 mL摇瓶,5、50 L发酵罐菌丝体水提物对羟基自由基清除效果较好,IC₅₀分别为（12.52±0.73）、（11.87±0.46）、（11.57±0.33） mg·mL^-1。研究结果可为灵芝液态发酵的工业化生产和应用提供参考。

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鳞杯伞多糖对玉米淀粉理化及结构特性影响

侯淑婷, 张德芳, 于东梅, 王无霞, 许亚萍, 孟俊龙, 常明昌, 耿雪冉

2025, 32(3): 102-112. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.010

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为探究鳞杯伞子实体多糖（Clitocybe squamulosa fruiting body polysaccharide, CSFP）对玉米淀粉理化及结构特性影响,分别向玉米淀粉中加入基于干基质0、2%、4%、6%、8%的CSFP,研究其糊化特性、流变性能、微观结构、红外光谱和质构特性。结果表明：CSFP能够延缓玉米淀粉的糊化,具体表现为随着CSFP添加量的增加,玉米淀粉糊化的峰值黏度、最低黏度、最终黏度、崩解黏度、回生黏度均下降,而糊化温度有所升高。静态流变结果显示玉米淀粉糊和复配体系均呈现剪切稀释的假塑性流体,且流体指数（n）和稠度系数（K）分别出现随CSFP添加量的增加而上升和下降的趋势;动态流变结果显示玉米淀粉糊和复配体系呈弱凝胶行为。通过扫描电镜对样品的微观结构进行观察,发现CSFP的加入使得样品内部结构逐渐松散,空隙变大。红外光谱扫描结果表明,形成的复配体系中未形成新的基团,添加CSFP后,淀粉结构的短程有序程度上升。研究结果表明,CSFP使得玉米淀粉糊的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和胶黏性均有所下降,以期为当前易吞咽食品的开发提供参考。

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灵芝孢子油中麦角甾醇测定方法的建立及应用

王金艳, 唐庆九, 周帅, 张劲松, 严培兰, 周靖

2025, 32(3): 113-119. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.011

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通过优化色谱条件,建立高效液相色谱测定灵芝（Ganoderma lucidum）孢子油中麦角甾醇含量的方法。方法学验证结果表明：麦角甾醇在2.5~100 μg·mL^-1呈良好的线性关系,R²为0.999 1;实验精密度、重复性、稳定性良好;样品加标回收率为95.21%~102.07%;该方法简单、准确、稳定,可以准确定量灵芝孢子油中的麦角甾醇含量,为灵芝孢子油的质量评价提供参考。运用建立的方法测定-20 ℃储存（冻藏）的不同生产批号的灵芝孢子油软胶囊,在室温和-20 ℃分别储存的相同生产批号的灵芝孢子油,及用同批原料生产的灵芝孢子油软胶囊和灵芝孢子油维生素E软胶囊中的麦角甾醇含量。结果表明：-20 ℃储存的不同生产批号灵芝孢子油软胶囊中麦角甾醇的含量有较大差异;储存温度显著影响孢子油中麦角甾醇含量,与-20 ℃储存相比,室温储存相同时间的孢子油中麦角甾醇含量降低32.1%~47.2%;室温储存条件下,与添加维生素E的孢子油相比,未添加维生素E的孢子油中麦角甾醇含量降低24.1%~28.7%,说明冻藏及添加维生素E可以有效减缓灵芝孢子油中的麦角甾醇含量的降低情况。研究结论可为建立灵芝孢子油产品质量评价的新方法提供参考。

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野生白灵侧耳种质资源遗传多样性分析和评价

宋爽, 刘宇, 武月园, 高琪, 吴灵芝, 张欣媚, 王守现

2025, 32(3): 120-130. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005一9873.2025.03.012

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基于简单序列重复区间（inter simple sequence repeat, ISSR）标记和农艺性状（5个质量性状和10个数量性状）对中国新疆塔城地区的52个野生白灵侧耳（Pleurotus tuoliensis）菌株进行遗传多样性分析,并基于数量性状对其进行综合评价。通过提取菌株菌丝体的基因组DNA进行PCR扩增,计算等位基因位点数、多态性位点数、多态位点百分率、有效等位基因数、香农多样性指数和Nei’s基因多样性指数,采用非加权配对算术平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA）构建52个白灵侧耳菌株的聚类图,采用SPSS16进行数量性状的Q型聚类和主成分分析。结果表明：10条ISSR引物共扩增获得64个多态性位点,Nei’s基因多样性指数平均值为0.25;UPGMA聚类分析可将52个菌株分为5个类群,菌株间遗传相似性系数为0.63~0.93;5个质量性状的香农多样性指数为1.01~1.26,10个数量性状的香农多样性指数为1.82~2.05,其中菌柄直径的遗传多样性指数最大,为2.05;当平方欧式距离为15时,Q型聚类可将52个菌株分为3大类,第一类包括菌株JZB2106018,第二类包括菌株JZB2106020,第三类包括其余50个菌株;综合得分较高的菌株是JZB2106048、JZB2106045和JZB2106039。结果表明,52个菌株的遗传多样性较丰富,其中综合得分较高的3个菌株的单菇重均较大。

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