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• 2023年, 第30卷, 第02期
  刊出日期：2023-04-15

    

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  Cys₂His₂型转录因子GL26016对灵芝菌丝生长和灵芝酸合成的影响

  周丁茜, 徐军伟

  2023, 30(02): 1-8. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.001

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  克隆灵芝 (Ganoderma lingzhi) 基因gl26016,全长为1 169 bp,开放阅读框为1 107 bp,序列分析表明该基因编码Cys₂His₂（C₂H₂）型转录因子。采用CRISPR/Cas9方法缺失该基因483 bp序列,通过PCR扩增及测序表明成功获得突变菌株△GL26016。对△GL26016与野生型菌株（WT）的菌丝生长和灵芝酸含量进行检测,结果表明：两者相比,菌丝形态和菌丝体干重差异不显著,△GL26016中灵芝酸含量较高。△GL26016中灵芝酸GA-Mk、GA-S、GA-Me在第6天的含量分别为（5.09±0.36）、（5.36±0.11）、（3.45±0.26） μg·mg^-1,分别是WT菌株积累量的1.51、1.47、1.93倍。研究结果表明GL26016参与灵芝酸生物合成调控。
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  基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统

  张志刚, 张劲松, 邹根, 唐传红, 冯杰, 鲍大鹏, 陈建波, 谭贻

  2023, 30(02): 9-18. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.002

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  构建密码子优化的cas9表达质粒pMD-EXP-cas9,通过聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）介导转化灵芝（Ganoderma lucidum）菌株‘沪农灵芝1号’ （‘Hunong No.1’）单核菌株L1,得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2,体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化,将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中,得到ura3基因被破坏的突变体,首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9）基因编辑系统,ura3基因的编辑效率为4个突变体（10⁷个原生质体）。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统,可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体（10⁷个原生质体）,本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。
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  利用非靶向代谢组学分析桉树加工副产物与常规基质栽培的肺形侧耳代谢物差异

  罗阳兰, 王灿琴, 胡秀月, 韦仕岩, 韦娇君, 吴圣进

  2023, 30(02): 19-31. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.003

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  采用气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry, GC-MS）技术,结合正交偏最小二乘判别分析法（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis, OPLS-DA）对处理组（桉树树皮和桉树木屑）与对照组（杂木屑和甘蔗渣）栽培基质的肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）子实体代谢物进行非靶向代谢组学（untargeted metabolomics analysis）研究。结果表明：与杂木屑相比,桉树树皮有7种差异代谢物和4种差异代谢物通路,桉树木屑有23种差异代谢物和5种差异代谢物通路;与甘蔗渣相比,桉树树皮有23种差异代谢物和5种差异代谢物通路,桉树木屑有26种差异代谢物和10种差异代谢物通路;相关性较强的代谢通路分别为C5-支链二元酸代谢通路与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路。研究结果为桉树加工主要副产物应用于食用菌栽培提供参考。
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  拟黏小奥德蘑的分离鉴定及生物学特性

  高杰, 何俊, 李琳, 王凯, 沈良优, 苏锡钧, 罗宗龙

  2023, 30(02): 32-46. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.004

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  在云南省昆明市石林彝族自治县圭山镇圭山国家森林公园采集得到野生小奥德蘑属（Oudemansiella sp.）标本,采用组织分离法获得纯培养菌株,并结合形态学和ITS序列分子系统发育分析进行物种鉴定,采用单因素结合正交实验分别对固体和液体培养条件进行筛选优化,采用袋料覆土栽培,在温度20~28 ℃、土壤湿度40%、空气湿度80%~90%的自然光照条件下的田间大棚开展驯化。结果表明：通过组织分离法获得纯培养菌株JF2004,将标本鉴定为拟黏小奥德蘑（O. submucida）;固体培养最佳条件为20.0 g·L^-1果糖、16.0 g·L^-1琼脂粉、2.0 g·L^-1酵母膏、0.5 g·L^-1碳酸钙、0.01 g·L^-1维生素B₁,温度26 ℃,pH 8.0;液体培养最佳条件为20.0 g·L^-1可溶性淀粉、2.0 g·L^-1酵母膏、0.5 g·L^-1磷酸氢二钾、0.01 g·L^-1维生素B₁,温度28 ℃,pH5.0;接种后约23 d菌丝满袋,覆土后第24天子实体成熟,栽培子实体与野生子实体相比,菌盖直径较大、颜色较浅;野生子实体菌环明显,而栽培子实体菌环较小或无菌环;野生子实体菌柄基部颜色变深,而栽培子实体通体白色,菌柄没有颜色变化。
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  庭院小鬼伞的培养特性及个体发育

  刘雅慧, 图力古尔

  2023, 30(02): 47-55. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.005

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  为探讨鬼伞类真菌的培养特性和丰富个体发育研究材料,通过对采集的野生子实体进行分离培养,基于内转录间隔区间（internal transcribed spacer, ITS）进行序列鉴定,通过培养菌丝测定生物学特性,通过出菇实验观察该菌各个发育阶段的形态,采用石蜡切片法观察个体发育过程。结果表明：该野生子实体为庭院小鬼伞（Coprinellus xanthothrix）;菌丝生长最适碳源为葡萄糖,最适氮源为蛋白胨,最适温度为25 ℃,最适pH为6~7;当培养料配方为37％木屑、33％玉米芯、18％麸皮、5％玉米粉、3％石灰、3％杨树枝及自然掉落的树叶、1％石膏时,可获得子实体;原基发育初时为菌柄菌盖发育型,很快转为同步发育型。
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  麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮诱导HepG2细胞凋亡及抗H22荷瘤小鼠肿瘤作用

  刘丁瑞, 王晓岩

  2023, 30(02): 56-64. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.006

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  采用硅胶柱层析法从多脂鳞伞（Pholiota adiposa）子实体中分离纯化出化合物F1-3,并通过电子轰击质谱及核磁方法鉴定其化学结构,确定该化合物为麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（ETO）。应用CCK8法测定ETO对HepG2、MCF7、HeLa及A549细胞增殖抑制率。在H22荷瘤小鼠体内进行ETO抗肿瘤实验,将小鼠随机分为模型组、阳性组（环磷酰胺CTX, 0.1×10^-3 mmol·kg^-1）及ETO组（低、中、高剂量分别为0.025、0.05、0.1 mmol·kg^-1）,计算脏器指数和抑瘤率;采用ELISA法测定小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6和VEGF含量,采用HE染色法观察肿瘤组织细胞排序、细胞完整度和细胞核数量,采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡程度,采用免疫组化法检测VEGF、Bcl-2和BAX蛋白表达水平。结果表明ETO对HepG2、MCF-7和HeLa细胞增殖具有抑制作用,100 μg·mL^-1ETO对HepG2细胞的抑制率高达91.04 %;在H22荷瘤小鼠体内实验中,ETO高剂量组抑瘤率达72.06%,且对小鼠胸腺、脾脏指数具有明显恢复作用,表现出抑制肿瘤生长的作用;免疫组化实验表明模型组小鼠肿瘤组织细胞排列整齐紧密,生长状态良好,凋亡率较低;ETO组小鼠肿瘤组织细胞出现不同程度的变形、破裂及模糊不清和大面积凋亡现象;与模型组相比,ETO可提高小鼠血清中IFN-γ、IL-2及IL-6含量,降低VEGF含量,通过降低VEGF、Bcl-2及升高BAX蛋白表达水平表现出较好的抗肿瘤作用。
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  蝉花中N⁶-(2-羟乙基)-腺苷提取工艺优化及结构鉴定

  艾仁丽, 谭艾娟, 吕世明

  2023, 30(02): 65-74. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.007

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  在单因素实验基础上,采用响应面法考察液料比、水浴温度、水浴时间对提取物中N⁶-（2-羟乙基）-腺苷[N⁶-(2-hydroxyethyl) adenosine, HEA]含量的影响,优化出HEA的最佳提取工艺：以超纯水为溶剂、液料比118∶1、超声时间25 min、水浴温度24 ℃、水浴时间3.8 h,获得提取物中HEA含量为(0.836±0.030) mg·g^-1。采用大孔树脂、酸性氧化铝层析柱和半制备高效液相色谱仪（semi preparative high performance liquid chromatography, SP-HPLC）分离纯化提取液中HEA,采用核磁共振及电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）和核磁共振氢谱（proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, ¹H NMR）鉴定分离出的物质为HEA,经高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）分析其纯度为99.32%。
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  香菇中麦角甾醇提取、表征及抗氧化、降胆固醇特性

  杨皓瑜, 程艳芬, 王胜男, 何丽霞, 曹谨玲, 程菲儿, 云少君, 冯翠萍

  2023, 30(02): 75-84. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.008

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  采用超声辅助皂化法提取香菇（Lentinula edodes）子实体麦角甾醇,通过单因素实验和正交实验优化提取条件,对麦角甾醇纯化产物表征、光稳定性进行分析,并测定其对羟基、DPPH自由基清除率和降胆固醇活性。结果表明：麦角甾醇最佳提取条件为料液比1∶40 （g:mL）、0.04 g·mL^-1 KOH、超声温度70 ℃、超声时间70 min,在此条件下麦角甾醇得率为（0.81±0.02）%,麦角甾醇纯化产物纯度为（86.18±3.49）%。与白炽光比较,紫外光照射麦角甾醇纯化产物的存留率显著降低。在实验范围内,1 mg·mL^-1麦角甾醇纯化产物对羟基、DPPH自由基清除率较高,清除羟基、DPPH自由基的IC₅₀分别为（12.96±1.36）、（6.68±0.98） mg·mL^-1。麦角甾醇纯化产物显著降低胆固醇在胶束中的溶解度。研究结果可为香菇麦角甾醇的利用提供参考。
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  野生瓦尼纤孔菌醇提物体外抗痛风活性

  宋吉玲, 王战伟, 陈佳慧, 舒玉婷, 方晨依, 李福森, 崔婧, 王晶

  2023, 30(02): 85-91. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.009

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  采用回流、超声、冷浸法制备瓦尼纤孔菌（Inonotus vaninii）子实体醇提物,测定其总多酚含量及对黄嘌呤氧化酶（XO）抑制率;采用尿酸钠（monosodium urate, MSU）诱导巨噬细胞RAW264.7建立急性痛风损伤模型,研究超声法制备的醇提物对TNF-α、IL-1β、活性氧、一氧化氮（NO）含量的影响。结果表明：回流法制备的醇提物对XO抑制率较高。与模型组相比,5.00 μg·mL^-1醇提物组的IL-1β含量显著降低,10.00、20.00 μg·mL^-1醇提物组的IL-1β、TNF-α含量极显著降低;5.00、10.00、20.00 μg·mL^-1醇提物组的活性氧含量极显著降低;10.00、20.00 μg·mL^-1醇提物组的NO含量分别显著、极显著降低。研究结果表明瓦尼纤孔菌醇提物具有潜在的体外抗痛风活性,可为其进一步开发利用提供参考。
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  秀珍菇枯萎病的病原菌鉴定及污染源分析

  陆娜, 闫静, 王伟科

  2023, 30(02): 92-101. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.010

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  从感染枯萎病的秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）样本中分离纯化病原菌,经柯赫氏法则验证TLH07菌株为病原菌,该菌株会导致菇体出现枯萎、菌盖凹陷等特征。经菌落形态、显微特征及16S rRNA、gyrB基因序列分析鉴定病原菌为美洲爱文菌（Ewingella americana）。病原菌对秀珍菇菌丝生长具有抑制作用。污染源调查发现,菌袋栽培料表层、内层、底层,棉塞和水源的细菌污染率分别为40%、6%、0%、17%和10%。接种操作不当可能是秀珍菇枯萎病发生的原因。本研究结果可为秀珍菇枯萎病病害的防控提供参考。
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  中华肉球菌附加模式标本指定

  高健耘, 刘世良, 邹胜男, 周昊, 侯成林, 周丽伟

  2023, 30(02): 102-110. https://doi.org/10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.011

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  中华肉球菌（Engleromyces sinensis M.A. Whalley, Khalil, T.Z. Wei, Y.J. Yao & Whalley）是分布于我国西南地区的珍稀药用真菌,具有显著的抗氧化和抗菌活性。由于中华肉球菌模式标本采集年代久远,难以获得DNA条形码序列,不利于该真菌资源的利用和保护。通过对中华肉球菌模式标本及新采集自云南、四川省的标本进行形态学比对,确定新采集的5个标本均为中华肉球菌。指定采集自模式产地云南省玉龙县的一个标本为中华肉球菌的附加模式标本,并对其进行形态描述和显微结构绘图;在此基础上,基于tef-1a、nrSSU、nrLSU和ITS多基因联合系统发育分析进一步确定中华肉球菌隶属于炭角菌科（Xylariaceae）。通过指定中华肉球菌的附加模式标本,并补充该物种的DNA条形码序列,为其后续开发利用和保护提供基础资料。